Dottorato in Fisiopatologia Medica

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RAZIONALE

Le malattie lisosomiali (LSD) sono un gruppo eterogeneo di circa quaranta disordini genetici ereditari che hanno come esito il difetto di un enzima lisosomiale, di una proteina lisosomiale non enzimatica o una proteina coinvolta nella biogenesi dei lisosomi. Il deficit di tale proteina, totale o parziale, porta all’accumulo di substrati di numerose vie cataboliche che tendono ad accumularsi nei lisosomi portando a disfunzione o morte cellulare. Le LSD possono insorgere a tutte le età ma molto spesso si manifestano già nell’infanzia e si presentano con uno spettro sintomatologico molto ampio che può comprendere deterioramento del sistema nervoso centrale, gravi anomalie scheletriche e disfunzioni multisistemiche a carico di cuore, reni, fegato, polmoni, milza. L’insufficienza multiorgano è, infatti, la principale causa di ospedalizzazione e di morte. Nel corso degli anni le terapie si sono rivolte principalmente al trattamento dei sintomi mentre da pochi anni per alcune di queste patologie è stata sviluppata la terapia enzimatica sostitutiva (ERT) che è lo standard terapeutico, tanto più efficace quanto più precocemente essa viene somministrata. Poiché le manifestazioni cliniche di tali patologie spesso sono assenti alla nascita, è difficile fare una diagnosi precoce. La diagnosi delle LSD è complicata anche a causa dell’eterogeneità delle manifestazioni, le quali generalmente non sono specifiche della patologia. Per il mio progetto di dottorato mi sono occupata di metodiche per la diagnosi di laboratorio di malattie lisosomiali.

 Nel corso del primo anno ho lavorato all’acquisizione, presso il laboratorio di Endocrinologia, di un saggio fluorimetrico per la diagnosi della malattia lisosomiale autosomica recessiva chiamata LAL deficiency (LAL-D). La LAL deficiency (LAL-D) è una malattia autosomica recessiva rara causata da una mutazione del gene LIPA il quale codifica per l’enzima Lipasi Acida Lisosomiale (LAL). Il deficit di tale enzima provoca un accumulo di esteri del colesterolo e trigliceridi nei lisosomi di numerosi tessuti (fegato, milza e sistema cardiovascolare). La LAL-D è quindi una patologia multisistemica e si presenta con due principali fenotipi: una forma rapidamente progressiva, chiamata malattia di Wolman (WD), e una forma a esordio più tardivo, definita CESD (Cholesterol Ester Storage Disease). Le principali manifestazioni cliniche di questa sindrome sono epatomegalia e steatosi non alcolica ma tali pazienti presentano anche splenomegalia e un coinvolgimento del sistema cardiovascolare con aterosclerosi prematura associata a dislipidemia. Attualmente non sono disponibili terapie specifiche per la LAL-D ma si utilizzano farmaci mirati a ridurre le complicanze legate al deficit enzimatico. Similmente a quanto già fatto per altre patologie da accumulo lisosomiale, si è pensato di intraprendere la strada per lo studio e l’introduzione della terapia enzimatica sostitutiva (ERT). A breve sarà disponibile in commercio un enzima ricombinante umano, la Sebalipasi alfa, che ha superato numerosi trial clinici. Da questi studi è emerso che, per ottimizzare al meglio l’effetto della ERT, è fondamentale avere una diagnosi il più possibile precoce. A tale proposito risulta importante disporre di un test efficace e affidabile per diagnosticare la patologia. La diagnosi di LAL-D può essere posta in seguito a dimostrazione dell’assenza dell’attività enzimatica oppure attraverso un’indagine genetica per ricercare mutazioni nel gene LIPA. La metodica per effettuare diagnosi di LAL prevede l’utilizzo del Dried Blood Spot (DBS) come matrice e l’attività enzimatica viene valutata attraverso l’impiego di un fluorimetro.

Durante il secondo anno mi sono dedicata all’acquisizione di una metodica di spettrometria di massa (MS/MS) per la diagnosi delle LSD. Lo studio si è concentrato su sei malattie appartenenti al gruppo delle LSD: malattia di Gaucher, malattia di Niemann-Pick, malattia di Pompe, malattia di Krabbe, malattia di Fabry e Mucopolisaccaridosi di tipo I. La malattia di Gaucher è causata dal deficit di β-glucocerebrosidasi acida (ABG) ed è caratterizzata dal deposito di glucosilcerebrosidi. Ha un’incidenza di 1:50000 nati vivi nella popolazione generale e si manifesta con organomegalia, patologia scheletrica e citopenia. La malattia di Niemann-Pick si presenta solitamente con epatosplenomegalia e disturbi neurologici progressivi e ha un’incidenza di 1:100000 nati vivi. La malattia di Pompe è causata dall’accumulo intralisosomiale di glicogeno a causa del deficit dell’enzima α-glucosidasi acida (GAA). Ha un’incidenza di 1:57000 nati vivi e si presenta con manifestazioni eterogenee che coinvolgono i muscoli scheletrici e i muscoli della respirazione. La malattia di Krabbe è una malattia della sostanza bianca del sistema nervoso centrale (SNC) e periferico (SNP) e ha un’incidenza di 1:100000 nati vivi. Mutazioni del gene β-galattocerebrosidasi (GALC) causano accumulo di psicosina citotossica che provoca l’apoptosi degli oligodendrociti e la demielinizzazione del SNC e SNP. La malattia di Fabry è una patologia multisistemica, progressiva, caratterizzata da specifici segni neurologici, cutanei, renali, cardiovascolari, cocleo-vestibolari e cerebrovasculari. L’incidenza annuale è di 1:80000 nati vivi. La carenza dell’enzima α-galattosidasi A (GLA) causa l’accumulo di Globotiaosilceramide (Gb3). Infine, la Mucopolisaccaridosi di tipo I è causata da depositi di dermatansolfato (DS) ed eparansolfato (HS) nei lisosomi. Ne esistono tre varianti di diversa gravità, i sintomi principali sono le deformità scheletriche e il ritardo psicomotorio e ha un’incidenza di 1:115000 nati vivi.

La diagnosi delle LSD è solitamente effettuata dimostrando l’assenza di attività dell’enzima tramite saggi fluorimetrici ed è confermata dalla ricerca della mutazione genetica. Recentemente però sono state sviluppate metodiche che si basano sulla spettrometria di massa (MS/MS). Questa tecnica permette di identificare un polipeptide mediante il “peptide mass fingerprinting”, cioè la generazione di uno spettro di oligopeptidi a partire dal polipeptide mediante una reazione chimica o enzimatica di frammentazione. La tecnica MS/MS utilizza due spettrometri di massa in tandem. Il primo spettrometro è usato per separare un precursore, presente in una miscela, il quale poi passa attraverso una regione in cui sono prodotti e attivati tali frammenti. Il secondo spettrometro è utilizzato per separare i frammenti in base alla loro massa. L’analisi dei frammenti ottenuti fornisce una misura accurata della quantità di polipeptide.

La diagnosi effettuata in MS/MS presenta numerosi vantaggi rispetto ai saggi fluorimetrici utilizzati quali una maggiore specificità, una migliore sensibilità e la possibilità di analizzare numerosi metaboliti simultaneamente. Il kit NeoLSD (Perkin-Elmer), utilizzato per lo studio, ha permesso di acquisire la metodica per il dosaggio dell’attività enzimatica per la diagnosi di alcune malattie da accumulo lisosomiale. Nello specifico: β-glucocerebrosidasi acida (ABG) per la malattia di Gaucher, sfingomielinasi acida (ASM) per la malattia di Niemann-Pick, α-glucosidasi acida (GAA) per la malattia di Pompe, β-galattocerebrosidasi (GALC) per la malattia di Krabbe, α-galattosidasi A (GLA) per la malattia di Fabry e α-L-iduronidasi (IDUA) per la Mucopolisaccaridosi di tipo I.

 MATERIALI E METODI

Il sangue del paziente, raccolto in una provetta contenente EDTA oppure attraverso puntura del dito, è stato utilizzato per produrre degli spot su carta Whatman (DBS), i quali sono lasciati ad asciugare overnight. I campioni così ottenuti sono conservati a -20°C con dissecante e devono essere analizzati entro una settimana. A partire dal DBS, è stato ritagliato un dischetto di 3mm di diametro che è la matrice dipartenza per entrambi i saggi.

Per il test diagnostico che utilizza la fluorimetria, il sangue presente nel dischetto viene estratto con acqua e analizzato incubando il campione per tre ore a 37°C con una soluzione di buffer acetato 0.15M (pH 4.0) con 1% Triton x-100, cardiolipina 0.5% (un attivatore della LAL) e del substrato fluorimetrico 4-metilumbelliferil (4mU) palmitato (13.3mM). Poiché la presenza di altre lipasi non specifiche nel sangue può interferire con la misura dell’attività della LAL, per ciascun campione è misurata sia l’attività totale che l’attività residua in seguito ad aggiunta di Lalistat2, un inibitore specifico della LAL. Alla fine delle tre ore di incubazione la reazione viene bloccata, viene preparata una curva standard con 4mU e la fluorescenza è misurata attraverso il fluorimetro VictorX2 Counter. L’unità di misura dell’attività della LAL è nmol/spot (punch)/h.

Nella metodica che utilizza la spettrometria di massa, il dischetto viene posto in incubazione a 37°C con un mix che contiene i substrati, gli standard interni (isotopi che marcano i prodotti generati) e un buffer che mantiene la reazione a pH acido e contiene inibitori che regolano l’attività enzimatica. Passate le 18 ore di incubazione, ai campioni sono aggiunti etilacetato e acqua e trasferiti in una piastra deep-well. A questo punto la piastra è centrifugata per separare lo strato acquoso, inferiore, dallo strato organico, superiore, nel quale sono contenute le molecole di interesse. Si preleva, poi, un’aliquota di campione dallo strato superiore ed è fatta essiccare per concentrare le molecole. È aggiunto infine il solvente e si inizia l’analisi. L’attività enzimatica è espressa in µmol/h/l.

 RISULTATI OTTENUTI

Il primo risultato ottenuto è stato l’acquisizione di metodiche non disponibili, verificandone e risolvendone le criticità dovute all’applicazione dei protocolli di riferimento: la selezione e l’acquisto dei reagenti necessari, la possibilità di utilizzo dei macchinari in nostro possesso e la fattibilità generale delle metodiche. Per la diagnosi fluorimetrica della LAL deficiency, sono stati analizzati soggetti normali (privi del sospetto diagnostico della deficienza della lipasi acida lisosomiale) e, tramite l’applicazione di criteri statistici, è stata descritta la distribuzione e definiti gli intervalli di riferimento. In particolare, utilizzando la curva Receiver Operating Characteristics (ROC) è stato possibile identificare diverse sottopopolazioni caratteristiche di questa patologia: soggetti normali, soggetti portatori e soggetti malati. Il successo di questa fase è stato sancito dalla perfetta sovrapposizione dei nostri intervalli di riferimento con quelli descritti in letteratura. È stato poi validato clinicamente il metodo dosando soggetti malati e soggetti portatori, verificando la robustezza e l’aderenza dei cutoff di patologia e normalità. Infine, è stato messo a disposizione il test dei clinici. Essendo la sua fruizione particolarmente utile in ambito epatologico, lipidologico e gastroenterologico (sia pediatrico che dell’adulto), abbiamo provveduto ad organizzare diversi incontri mirati alla sensibilizzazione degli specialisti in tali settori.

La misurazione dei sei enzimi lisosomiali, attraverso la spettrometria di massa, nei soggetti di controllo adulti ci ha permesso di capire quale fosse la distribuzione della loro attività e quali le mediane. Tutti gli enzimi hanno manifestato comportamento non gaussiano e le mediane sono state 3.5 (ABG), 3.2 (ASM), 4.3 (GAA), 2.0 (GALC), 5.1 (GLA) e 4.2 (IDUA). Tutti i valori dei soggetti di controllo in nostro possesso, affetti da differenti patologie da accumulo lisosomiale, hanno mostrato valori di attività enzimatica inferiori alla norma, tranne i soggetti femminili affetti dalla malattia di Fabry: il difetto enzimatico di tale patologia, infatti, è X-linked, di conseguenza le donne affette presentano valori di attività costituzionalmente più alta rispetto ai maschi.

 SVILUPPI FUTURI

Per il futuro ci prospettiamo di consolidare l’attività diagnostica di screening per il deficit di lipasi acida lisosomiale, continuando la ricerca in modo da ottenere miglioramenti del test e favorendo la sensibilizzazione sul territorio. Parteciperemo, inoltre, a differenti protocolli di ricerca clinica (in ambito pediatrico e dell’adulto) rivolti a una migliore caratterizzazione e comprensione della malattia in ambito endocrino-metabolico. In particolare, affronteremo studi per caratterizzare meglio la popolazione dei portatori, scarsamente studiati in letteratura, e per caratterizzare la presenza di LAL-D in soggetti con disfunzione metabolica (diabetici, obesi, dismetabolici) che presentino un coinvolgimento epatico (steatosi epatica, innalzamento degli enzimi epatici e del profilo lipico).

La metodica che utilizza la spettrometria di massa ha mostrato una specificità superiore rispetto alla metodica in fluorimetria e presenta indubbi vantaggi, tra i quali l’analisi di numerosi metaboliti contemporaneamente. Nel futuro diventerà importante ampliare il numero dei metaboliti analizzabili attraverso la spettrometria di massa in modo da includere nel pannello anche un gruppo di Mucopolisaccaridosi ora non presenti. La metodica sarà utilizzata in progetti pilota (come avviene già in altre regioni) per inserire lo screening delle sei patologie lisosomiali all’interno dello screening metabolico allargato neonatale. Tale metodica si presta anche a ulteriori sviluppi futuri per misurare marker alternativi di alcune LSD come la globotriosilsfingosina (lyso-Gb3) per la malattia di Fabry o la glucosilsfingosina (lyso-GL1) per la malattia di Gaucher. Questi sono marker utili in particolar modo per caratterizzare lo stadio della malattia e per monitorare il follow-up terapeutico.

I risultati di questi studi saranno oggetto di pubblicazioni su riviste scientifiche specializzate; nello specifico sono in fase di stesura due articoli che racchiudono le nostre esperienze con gli argomenti sopra citati. Un articolo dal titolo “An experience on diagnosis of Lysosomal Storage Diseases (LSD) by mass spectrometry” sarà sottomesso ad una rivista del settore della biochimica clinica mentre un secondo manoscritto dal titolo “Distribution of Lysosomal Acid Lipase activity in adulthood and childhood in Piedmont” ad una rivista del settore delle malattie rare.

Attività di ricerca